ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ИНФАРКТА МИОКАРДА: СОВРЕМЕННЫЕ ТРЕБОВАНИЯ Д.С.Бенево...

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ИНФАРКТА МИОКАРДА: СОВРЕМЕННЫЕ ТРЕБОВАНИЯ Д.С.Беневоленский Представительство компании «Радиометр Медикал АпС» (Дания)

Резюме: Лабораторные методы на сегодняшний день играют ключевую роль в диагностике инфаркта миокарда. Однако все существующие на сегодняшний день биомаркеры некроза кардиомиоцитов не идеальны. Наиболее чувствительны и специфичны тропонины I и T. Наименее специфичен миоглобин, но он быстрее появляется в крови после инфаркта. Промежуточными характеристиками обладает третий рекомендованный биомаркер – креатинкиназа MB.  Для точного определения верхней границы нормы для биомаркеров аналитический метод должен обладать высокой чувствительностью и специфичностью. В результате использования производителями разных наборов антител в иммунохимической реакции и отсутствия четкой стандартизации концентрации биомаркеров, измеренные на разных анализаторах, часто не совпадают. Каждый анализатор имеет свои референтные диапазоны. Это относится, прежде всего, к тропонину. В кардиологии очень важна быстрота постановки диагноза, поэтому все большее значение приобретает проведение анализа непосредственно у постели больного. Некоторые современные анализаторы, как например Radiometer AQT90 FLEX, позволяют очень просто получить высококачественный результат измерения биомаркеров.

Ключевые слова: инфаркта миокарда, диагностика, тропонин, миоглобин, креатинкиназа MB.   Сегодня биохимические маркеры играют ключевую роль в точной диагностике инфаркта миокарда, и, что очень важно, в оценке риска неблагоприятного исхода и выборе наиболее адекватного метода лечения.  Впервые лабораторный метод диагностики инфаркта миокарда (измерение активности аспартатаминотрансферазы в крови) был применен более 50-ти лет назад [5]. С тех пор роль лабораторных методов в кардиологии постоянно возрастала. Произошел знаменательный переход от измерения активности аспартатаминотрансферазы и лактатдегидрогеназы к трем широко применяемым сегодня биомаркерам: миоглобину, креатинкиназе MB (КФК-MB) и тропонинам I и T. Вначале результаты лабораторных исследований рассматривались лишь как дополнение к клиническому обследованию и ЭКГ. Но в 2000 году и затем в 2007 году решением наиболее авторитетных американских, европейских и международных кардиологических ассоциаций диагноз инфаркта миокарда был впрямую связан с повышением уровня биомаркеров (предпочтительно тропонина) в крови [12]. Все остальные методы клинического и функционального обследования призваны лишь подтвердить ишемическую природу наблюдаемого некроза миокарда. В опубликованном документе подчеркивается ключевая роль биомаркеров в диагностике: «Термин инфаркт миокарда следует использовать при наличии данных о некрозе миокарда на фоне клинической картины, соответствующей ишемии миокарда». Причем под данными о некрозе миокарда понимается «выявление роста и/или падения уровня сердечных биомаркеров (предпочтительно тропонина) с, по крайней мере, одной величиной, превышающей верхний референтный предел», а достаточным свидетельством ишемии считается хотя бы одно из следующего:
•        Наличие симптомов ишемии;
•        Изменения ЭКГ, свидетельствующие о появлении ишемии (появление изменений ST-T или появление блока левой ножки пучка Гиса);
•        Развитие патологического зубца Q на ЭКГ;
•        Данные лучевой диагностики, свидетельствующие о потере жизнеспособного миокарда или появлении локального нарушения движения стенки. Почему же в лабораторной диагностике центральное место заняло измерение уровня тропонина?
В таблице 1 приведены свойства идеального биомаркера инфаркта миокарда.

Таблица 1. Свойства идеального биомаркера некроза миокарда [3].

 На сегодняшний день ни один из существующих биомаркеров не удовлетворяет всем перечисленным критериям. Наиболее близки к идеалу тропонины I и T. Их основное преимущество – уникальная специфичность для миокарда. Тропонины – белки сократительного аппарата мышц. Они входят в состав тропонин-тропомиозинового комплекса тонких миофибрилл. Этот комплекс регулирует взаимодействие сократительных белков актина и миозина и, тем самым,  обеспечивает смену сокращения или расслабления мышц. Имеются три типа тропонина –   C,I иT.  Все они – небольшие белки с молекулярной массой 20–40 тыс. ТропонинT связывает остальные тропонины и тропомиозин в единый комплекс. В расслабленной мышце тропонин I предотвращает взаимодействие головки миозина с актином и препятствует сокращению. Возбуждение кардиомиоцита приводит к повышению внутриклеточной концентрации ионовCa2+, которые связываются с тропонином C.  Конформация всего комплекса изменяется, и актин освобождается от ингибирующего влияния тропонина I – происходит сокращение мышцы. Тропонин C – один из очень консервативных белков. Так, тропонинCиз скелетных мышц человека отличается от тропонина C из сердца быка лишь одной аминокислотой [10]. Другими словами, тропониныCсердца и медленных скелетных мышц практически идентичны. Напротив, сердечные изоформы тропонинов I иTэкспрессируются только в сердце, тогда как изоформы аналогичных тропонинов быстрой и медленной скелетных мышц – это продукты других генов. Будучи частью сократительного аппарата, тропониныIиT присутствуют в клетках миокарда в высокой концентрации. В крови здоровых людей концентрация этих белков крайне мала, но в случае инфаркта миокарда она возрастает в десятки раз (рис.1), причем повышенная концентрация сохраняется в течение нескольких дней, в некоторых случаях до одной, а для тропонина T и двух недель. По общему мнению экспертов, концентрация тропонинов в крови возрастает лишь при необратимом разрушении (некрозе) кардиомиоцитов, хотя причины некроза могут быть разные. К сожалению, тропонины –  структурные белки, и они появляются в крови не сразу, обычно через 4-6 часов после инфаркта. Правда, повышение чувствительности современных тестов все более сокращает это время. Кинетика выведения тропонинов неоднозначна и зависит от функции почек.  Тропонины I иT содержатся в миокарде в эквимолярном количестве, они оба уникальны для сердца, и хотя это разные белки, с точки зрения диагностики инфаркта миокарда, оба тропонина I иT совершенно равнозначны, и все международные рекомендации не делают различия между ними.Если нет возможности измерить концентрацию тропонина, то международные рекомендации предлагают в качестве альтернативы измерить уровень креатинкиназы MB (по массе, а не по активности!) [7]. До недавнего времени именно этот показатель был «золотым» стандартом в лабораторной диагностике инфаркта миокарда в силу его относительной специфичности для миокарда.  Креатинкиназа MB – фермент, катализирующий перенос высокоэнергетического фосфата с креатинфосфата на АТФ и участвующий в транспорте энергии от митохондрий к сократительному аппарату. Для интенсивной и непрерывной работы сердцу нужен постоянный приток энергии, поэтому этот фермент содержится к кардиомиоцитах в большом количестве. Креатинкиназа состоит из двух субъединиц и имеет молекулярную массу около 42 тыс. Известны два вида субъединиц MиB, и соответственно три изофермента MM, BB и MB. КФК-MM преобладает в скелетных мышцах, и на долю КФК-MB приходится лишь 1–3%. В миокарде основной изофермент также КФК-MM, но примерно 15% приходится на долю КФК-MB. Поэтому повышение уровня КФК-MB в крови специфично (но не абсолютно!) для поражения миокарда. Активность гена, кодирующего субъединицуB, может повышаться, например, в регенерирующей скелетной мышце, что снижает специфичность этого биомаркера. КреатинкиназаMB – менее чувствительный биомаркер, чем тропонин. Показано, что почти у 30% больных, поступивших с болью в груди, без подъема сегментаST на ЭКГ и без повышения уровня креатинкиназы КФК-MB, в действительности был инфаркт миокарда, как показало измерение уровня тропонина. Для пациентов, поступивших в течение 6 часов с начала болевого международные рекомендации предусматривают определение раннего биомаркера некроза миокарда в дополнение к сердечному тропонину [7]. Миоглобин – наиболее изученный биомаркер для этой цели. Это небольшой гем-содержащий растворимый белок скелетных мышц и миокарда (м.м. 17 500). Его основная функция – транспорт кислорода в мышцах. Благодаря высокой растворимости и небольшому размеру, миоглоблин быстро освобождается при поражении мышц и выводится почками. Основной недостаток миоглобина, как биомаркера, – низкая специфичность. Нормальный уровень миоглобина помогает исключить диагноз инфаркта миокарда. Но его повышение может быть связано и с различными поражениями скелетных мышц.Каковы же нормальные концентрации биомаркеров в крови, и что считать доказанным повышением их уровня?
Согласно рекомендациям Национальной академии клинической биохимии (США) и Международной федерации клинической химии  и лабораторной диагностики, для каждого биомаркера необходимо установить верхнюю границу нормальных значений на основе исследования группы здоровых людей, не имеющих заболеваний сердца в анамнезе [1,2].  Для тропонинов (T и I) и креатинкиназы MB пороговым значением для выявления поражения сердца признан 99-й процентиль результатов измерения в группе здоровых людей. Это означает, что у 99 % здоровых людей уровень соответствующего аналита в плазме оказывается ниже указанного порога. Наоборот, превышение этого порога свидетельствует о поражении миокарда.  Причем для креатинкиназы MB исследования должны быть проведены отдельно для мужчин и женщин, так как у мужчин величина 99-го процентиля в 2–3 раза выше, чем у женщин. Имеются и расовые различия. Для концентрации миоглобина в качестве границы нормы принят 97,5-й процентиль. В идеале каждая лаборатория должна установить собственный референтный диапазон, но, учитывая сложность проведения такого исследования, допускается ориентироваться на цифры, приведенные производителями.В приведенном  выше определении инфаркта миокарда очень важны слова «рост или падение» уровня биомаркера.  То есть в идеале нужно выявить новый пик концентрации биомаркера в крови, соответствующий клинической картине. Для этого концентрацию биомаркера необходимо измерить минимум дважды, причем измерить количественно. Для большинства пациентов показано взятие проб крови при поступлении и через 6-9 часов [7]. После подтверждения диагноза инфаркта миокарда последующие измерения биомаркеров поражения миокарда (примерно раз в сутки) позволяет оценить размер инфаркта и оценить риск осложнений для данного пациента. Точная оценка риска сердечно-сосудистого заболевания исключительно важна для принятия клинического решения, поскольку для выбора наилучшего способа лечения каждого конкретного пациента необходимо взвесить преимущества, опасность и стоимость различных методов лечения [4]. Из перечисленных биомаркеров труднее всего измерить в крови концентрацию тропонина, поскольку в норме она исключительно низка. Для точного определения верхней границы нормы (99-го процентиля) аналитическая чувствительность метода измерения должна быть достаточной для определения концентрации тропонина в крови если не всех, то, по крайней мере, многих здоровых людей. На рис.2 показано «истинное» распределение концентрации тропонина I в крови у здоровых людей и больных инфарктом миокарда. Граница нормы на уровене 99-го процентиля распределения концентрации тропонина I у здоровых людей наилучшим образом позволяет отличить больных от здоровых [2]. Если метод анализа имеет предел обнаружения (1), то этот порог можно установить достаточно точно определить.  Метод с пределом обнаружения (2), безусловно, выявит большинство больных с инфарктом миокарда, но истинная граница нормы остается неизвестной, а потому у части больных поражение миокарда остается недиагностированным.
Согласно рекомендации Международной федерации клинической химии и лабораторной медицине (IFCC), для снижения влияния неспецифических факторов аналитическая чувствительность должна быть примерно в 5 раз ниже клинически значимого порогового уровня [9]. Кроме того, погрешность измерения на пороговом уровне должна быть достаточно низка [1]. Погрешность определяется величиной коэффициента вариации (CV), который равен: CV = SD/M*100%, где M – среднее арифметическое результатов измерения данной концентрации, а SD – стандартное отклонение. На уровне верхней границы нормы погрешность должна составлять не более 10%, иначе тест будет давать много ложно-положительных и ложно-отрицательных результатов.К сожалению, изложенные рекомендации далеко не всегда выполняются в реальной жизни.
На официальном сайте Международной федерации по клинической химии и лабораторной медицине [http://www.ifcc.org/PDF/IFCC_Troponin_Web_Page_Table_of_Assays_Oct_2008.pdf] приведены аналитические характеристики для 19 тестов на тропонины IиTразных производителей (данные на октябрь 2008). Лишь у 12 из них предел обнаружения меньше верхней границы нормы, то есть для остальных тестов верхняя граница нормы (99-й процентиль) фактически не была установлена.   С точностью измерения дело обстоит еще хуже. Даже на уровне, в два раза превышающем границу нормы,  коэффициент вариации не превышает 10% лишь у восьми тестов. Таким образом,  аналитическое качество – очень важная и до конца не решенная тема, на которую стоит обратить пристальное внимание.Все имеющиеся на сегодняшний день методы определения концентрации тропонина основаны на иммунохимической реакции, так называемом «сэндвич»-анализе. Качество получаемого результата зависит от правильности выбора антител. Тройной комплекс из тропонинов I,TиC, попадая из разрушенных кардиомиоцитов в кровь, распадается на свободный тропонин T и двойной комплекс из тропониновIиC. Это и есть основные формы тропонинов в крови. В крови под действием протеаз начинается отщепление концевых фрагментов молекул тропонина (рис. 3). Поэтому используемые для анализа антитела должны взаимодействовать с центральной, наиболее стабильной частью молекулы тропонина. Кроме того, тропонин I может быть в фосфорилированной/ дефосфорилированной, а также окисленной/ восстановленной формах. Связывание антител, выбранных для анализа, не должно зависеть от химической модификации молекулы тропонинаI.  Помимо этого, центральная часть молекулы тропонина I – объект взаимодействия с аутоантителами, которые, блокируя связывание антител теста, могут приводить в ложно-отрицательным результатам анализа. Наличие аутоантител к тропонину I – достаточно распространенное явление. Они обнаружены у 5,5 % людей без признаков сердечно-сосудистых заболеваний и у 21 % больных с острым коронарным синдромом [6]. Попытки производителей преодолеть указанные трудности и подобрать наилучшее сочетание антител для анализа приводят к использованию антител к разным эпитопам.
В результате использования производителями разных наборов антител в иммунохимической реакции и отсутствия четкой стандартизации концентрации биомаркеров, измеренные на разных анализаторах, часто не совпадают.  При практически идеальной корреляции величин, полученных наилучшими методами измерения, абсолютная величина концентрации может различаться на порядок. Поэтому прямое сравнение абсолютных значений невозможно, а границы нормы должны быть определены отдельно для каждого анализатора. И хотя клиническая интерпретация результатов с учетом соответствующих референтных диапазонов в целом совпадает для всех тестов, эта ситуация создает очевидное неудобство. Здесь необходим вдумчивый клинико-лабораторный консилиум для выработки общих правил оценки результатов, полученных, например, на портативных анализаторах у постели больного и в центральной лаборатории, для каждой конкретной больницы.  В диагностике и лечении инфаркта миокарда критическую роль играет время. Реперфузия, начатая в течение первого часа после начала инфаркта миокарда, сопровождалась 1% летальностью, тогда как то же лечение, начатое через 6 и более часов, приводило к 10% летальности [11].  По общему мнению клиницистов и врачей-лаборантов, время до получения ответа из лаборатории о концентрации сердечных биомаркеров в пробе крови не должно превышать 60 мин [7].В действительности мало где круглосуточно обеспечивается такая скорость выполнения анализов. Поэтому Национальной академией клинической биохимии (США) даны следующие четкие рекомендации [8]:
·       Лаборатория должна измерить сердечные биомаркеры в течение 1 часа, лучше - за 30 и менее минут. Время рассчитывается от забора пробы до сообщения результата.
·       Учреждения, неспособные постоянно обеспечить получение результатов измерения сердечных биомаркеров примерно за 1 час, должны использовать анализаторы у постели больного.
Приближение анализаторов к больному, то есть перемещение их из лаборатории в клинические отделения, несет с собой новые проблемы. Прежде всего, необходимо обеспечить максимальную простоту работы при минимальной потребности в обслуживании. Анализатор будет использовать персонал клинического отделения, не имеющий специального лабораторного образования. Следует учитывать и текучесть кадров, часто препятствующую своевременной дополнительной подготовке персонала. При этом необходимо обеспечить лабораторное качество анализа (высокую чувствительность и точность измерения) и достаточную производительность. Оптимальной схемой считается сохранение контроля лабораторных специалистов за всеми приборами, расположенными в отделениях. Подключение анализатора к внутрибольничной информационной системе, обеспечивающей возможность удаленного доступа с лабораторного компьютерного терминала, значительно облегчает такой контроль.
Примером анализатора, наиболее полно соответствующего всем указанным требованиям, служит новый иммунофлюоресцентный анализатор AQT90FLEX производства компании «Радиометр Медикал АпС» (Дания), показанный на обложке этого журнала. Это достаточно компактный настольный прибор, способный измерять все указанные биомаркеры некроза миокарда (тропонин I, креатинкиназу MB, миоглобин). Уже на будущий год к ним присоединится и тропонинT. Кроме того, можно измерить биомаркеры сердечной недостаточности (NT-proBNP), активации системы свертывания (D-димер), воспаления (СРБ) и беременности (β-субъединицу человеческого гонадотропина). Оператор может свободно выбрать необходимые параметры, измерение которых идет параллельно.  Важно, что не требуется никакой предварительной обработки пробы крови. Для измерения нужно лишь вставить закрытую стандартную вакуумную пробирку с пробой в анализатор, выбрать параметры и получить результат и закрытую же пробирку. Контакт с кровью или отходами в процессе анализа исключен. Все процессы максимально автоматизированы, есть возможность подключения анализатора к информационным системам. Все это позволяет легко использовать анализатор для экспресс-диагностики непосредственно в отделении. В то же время, результат измерения соответствует самым высоким лабораторным стандартам. Врачам не придется больше уточнять диагноз, посылая пробу в центральную лабораторию.  В таблице 2 приведены данные по аналитическому качеству измерения основных биомаркеров некроза миокарда.
Таблица 2. Аналитическое качество измерения анализатора AQT90FLEX.

  Результаты измерения тропонина на AQT90 FLEX практически идеально коррелируют с результатами лабораторного анализатора TnI-Ultra ADVIA Centaur (Siemens) и коэффициент корреляции R2 = 0,984. Таким образом, современные требования к лабораторной диагностике инфаркта миокарда сводятся к быстрому и точному определению биомаркеров (предпочтительно тропонина). Для этого помимо лабораторных необходимы и внелабораторные анализаторы, которые бы были просты в обращении и давали бы количественный результат, сопоставимый по точности с данными лаборатории. Применение подобных анализаторов непосредственно в отделениях скорой помощи и отделениях реанимации позволит повысить качество медицинской помощи в неотложных ситуациях.

Список литературы
1.      Apple FS, Jesse RL, Newby LK, Wu AH, Christenson RH. National Academy of Clinical Biochemistry and IFCC Committee for Standardization of Markers of Cardiac Damage Laboratory Medicine Practice Guidelines: Analytical issues for biochemical markers of acute coronary syndromes. Circulation. 2007 Apr 3;115(13): e352-5. 2.      Apple FS, Quist HE, Doyle PJ, Otto AP, Murakami MM. Plasma 99th percentile reference limits for cardiac troponin and creatine kinase MB mass for use with European Society of Cardiology/American College of Cardiology consensus recommendations. Clin Chem. 2003 Aug;49(8): 1331-6. 3.      Cardiovascular biomarkers : pathophysiology and disease management (edited by David A. Morrow).2006 Humana Press Inc. p.6. 4.      Criteria for Evaluation of Novel Markers of Cardiovascular Risk. A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation. 2009; 119: 2408-2416. 5.      Karmen A, Wroblewski F, LaDue JS. Transaminase activity in human blood. J Clin Invest 1954;34:126–133. 6.      Kim Pettersson, Susann Eriksson, Saara Wittfooth, Emilia Engström, Markku Nieminen and Juha Sinisalo. Autoantibodies to Cardiac Troponin Associate with Higher Initial Concentrations and Longer Release of Troponin I in Acute Coronary Syndrome Patients. Clinical Chemistry. 2009;55:938-945. 7.      Morrow DA, Cannon CP, Jesse RL, Newby LK, Ravkilde J, Storrow AB, Wu AH, Christenson RH, Apple FS, Francis G, Tang W. National Academy of Clinical Biochemistry Laboratory Medicine Practice Guidelines: Clinical characteristics and utilization of biochemical markers in acute coronary syndromes. Clin Chem. 2007 Apr; 53(4): 552-74. 8.      National Academy of Clinical Biochemistry: Laboratory Medicine Practice Guidelines: Evidence-Based Practice for Point-of-Care Testing. (Editor James H. Nichols) AACCPress. 2006. 9.      Panteghini M, Gerhardt W, Apple FS, Dati F, Ravkilde J, Wu AH. Quality specifications for cardiac troponin assays. Clin Chem Lab Med. 2001 Feb;39(2):175-9. 10.   Romero-Herrera, A. E.; Castillo, O.; Lehmann, H. : Human skeletal muscle proteins: the primary structure of troponin C. J. Molec. Evol. 8: 251-270, 1976. 11.   Rosalki SB, Roberts R, Katus HA, Giannitsis E, Ladenson JH, Apple FS. Cardiac biomarkers for detection of myocardial infarction: perspectives from past to present. Clin Chem. 2004 Nov;50(11): 2205-13. 12.   Thygesen K, Alpert JS, White HD on behalf of Joint ESC/ACCF/AHA/WHF Task Force for the Redefinition of Myocardial Infarction. Universal definition of myocardial infarction. Circulation. 2007 Nov 27; 116(22): 2634-53.  

   
Рисунок 1. Рост уровня маркеров в крови при инфаркте миокарда [7].

Рисунок 2. Предел обнаружения у хорошего (1) и недостаточно чувствительного теста (2) по отношению к истинной границе нормы для концентрации тропонина I.

 
Рисунок 3. Факторы, влияющие на выбор антител для определения тропонина I.